白蛋白（albumin）是由肝细胞排泄的一种水溶性蛋白。从肝脏组成后会排泄到血液内，担任转运激素，脂肪酸，调理 pH 值等多种生物学功用 。
研讨显现肝内肿瘤细胞内白蛋白的检测能够有用判别肝脏肿瘤细胞是否为原发肝细胞来历。因为本身归于排泄型蛋白，一旦组成则会被排出细胞外，因此关于白蛋白的原位检测很难经过惯例免疫组化的办法得到满足的成果；因此 RNA 原位杂交成为原位检测 albumin 的首选办法。
RNAscope 技能是新一代 RNA 原位杂交技能，其改造的探针规划原理和信号扩大体系使得 RNA 原位杂交的灵敏度和特异性比传统原位杂交提高了约 4,000 倍，为此，美国多家研讨机构运用了 RNAscope 技能原位检测 Albumin 的 mRNA，剖析其在肝细胞肝癌和肝内胆管癌辨别确诊中的效果。
亚特兰大埃默里大学医学病理研讨中心的 Avadhani V 等人在 22 例肝细胞肝癌（HCC）中运用该技能检测到 100% 的 albumin 阳性 mRNA 信号；美国明尼苏达州的梅奥医学中心（Mayo clinic）的 Lehrke 等人在 26 例 HCC 中悉数样本都检测到了 albumin 的 mRNA 表达。
在此基础上，来自盖辛格医疗中心（Geisinger Medical Center）、加利福尼亚大学洛杉矶分校医学病理中心以及美国 ACD 公司的科学家们在 2018 年的《美国临床病理学杂志》上联合对肝细胞肝癌、肝内胆管癌（ICC）以及其他安排器官肿瘤进行了 Albumin 的 RNA 原位检测，剖析运用 RNAscope 办法检测 Albumin 关于辨别确诊 HCC、ICC 以及从其他部位肿瘤肝搬运的特异性和灵敏性[1]。
这项研讨中，该团队运用了临床白腊样本制备成的安排芯片，即几张芯片上包含有共 482 个病例白腊块来历的安排 core，其间肝细胞肝癌（HCCs）37 例，乳腺导管癌 68 例，肺腺癌 40 例，食管腺癌 35 例，胰腺腺癌 50 例，尿路上皮癌 40 例，子宫内膜癌 40 例，宫颈癌 26 例，卵巢浆液癌 42 例，肾乳头瘤 32 例，间皮瘤 22 例以及甲状腺乳头瘤 50 例。
此外，还有 22 例肝内胆管癌（其间 14 例外科手术取得和 8 例活检样本）以及 20 例正常肝脏和 20 例正常胰腺样本也在该研讨的检测样本规模内。作为肝外胆管癌的 Hilar carcinomas 和 Klatskin tumors 被扫除在本研讨中。
在进行 RNAscope 检测时，一切的 TMA 样本进行了手动 RNAscope 办法的检测，检测时运用到阳性对照探针 Hs-PPIB，阴性对照探针 DapB 以及人白蛋白探针（Hs-ALB）。运用到的试剂盒为 RNAscope 单通道棕染试剂盒。之后 37 例肝细胞肝癌（HCC）和 20 例正常肝脏样本运用了 Leica Bond III 全主动染色仪进行了 albumin mRNA（运用 Hs-ALB 探针）重复检测。
一切的染色成果在可见光镜下进行调查评分，评分规范见文末。
RNAscope 成果由两位病理学家独自评分，假如发作判读成果存在差异，则两位病理学家一起复评成果并到达共同。实践成果评分判读中，因为该评分体系很简单对成果进行评价，未出现两位病理学家评判成果不共同且后期无法到达一致的现象。
在此项研讨中，37 例肝细胞肝癌（HCCs）中有 36 例检测到 albumin 的 mRNA，一切成果评分均在 3 分或许 4 分。仅有的 1 例肝细胞肝癌显现 Albumin 阴性的病例，表现为低分解安排细胞形状，CK7 免疫组化和 arginase-1 免疫组化均为阴性。
在非肝细胞肝癌和非肝内胆管癌的病例中，除了 1 例肺腺癌显现出 albumin 的 RNA 信号为 3 格外，其他均为 albumin 阴性。这例仅有的 albumin 阳性肺腺癌病理表现为 CK7 和甲状腺转录因子 1 阳性。
在 22 例肝内导管癌中，有 14 例（包含手术选材 10 例和活检 4 例）为 albumin 的 RNAscop 检测显现阳性，其间有 10 例评分为弥漫型 3 或 4 分。20 例正常肝脏样本中的肝细胞内，RNAscope 检测到的 albumin 的评分为 4 分，肝胆管会集区域的评分为 1 或 2 分。
正常胰腺和正常胆管内的 albumin 的 RNAscope 信号低于肝细胞内 albumin。胰腺导管，胰岛和胰腺基质细胞内未出现 albumin 的 RNA 信号。运用 Leica Bond III 全主动办法检测到的成果与手动检测成果完全共同。以上成果的示意图见图 1 和图 2。
图 １，运用 RNAscope 办法检测肝细胞肝癌（HCC，A），仅有一例阳性的肺腺癌（B），肝内胆管癌（ICC，C）和活检选材的肝内胆管癌（D）的高倍镜下成果。图中棕色信号点为 RNAscope 检测到的 albumin 的信号。
图 2，运用 RNAscope 办法检测正常肝细胞和门胆管（A）和良性胰腺滤泡（B）内 Albumin 的 RNA 成果。图中棕色信号点为 RNAscope 检测到的 albumin 的信号。
此项成果与亚特兰大埃默里大学医学病理研讨中心的 Avadhani V 等人的研讨成果以及美国明尼苏达州的梅奥医学中心（Mayo clinic）的 Lehrke 等人的成果进行了汇总，见表 1 和表 2。
表 1，肝细胞肝癌不同研讨项目比照成果：
表 2，肝内胆管癌不同研讨项目比照成果：
多项研讨成果可见运用 RNA 原位杂交的办法原位检测 albumin mRNA，在肝细胞肝癌（HCC）中的检出率为 97～100%，且检测成果不受安排样本制备类型（TMA 或许全安排切片）的影响，检测的新办法具有高度灵敏性。
在肝内胆管癌（ICC）的检测中，三项研讨得到的 albumin 的检出率分别为 45%（亚特兰大埃默里大学医学病理研讨中心），81.5%（梅奥医学中心）和 64%（本次）。形成这个成果的或许性有：
在不同研讨中关于肝内胆管癌的入组挑选存在不同，例如有的研讨并没有扫除 Klatskin tumor；
ICC 中 albumin 的信号散布没有 HCC 散布那样广泛，而 TMA 样本本身只在全安排切片上取很小的一个 core 制备而来， 故有或许错过了阳性表达区域；
有研讨以为肝内胆管癌本身有两类癌细胞种系来历，一种是从肝干细胞来历，另一种为外周胆管腺体安排来历的干细胞发作。假如是肝干细胞来历，则细胞内具有更多偏肝细胞的特性，包含白蛋白的排泄才能。而假如为后者来历，则很少或许不表达 albumin。
总而言之，运用 RNAscope 原位检测 albumin mRNA 能够轻松又有用检测肝细胞肝癌，对肝内胆管癌也有较好的检测效果。能够在必定程度上协助很好的辨认肝细胞来历的癌细胞，与肝外搬运瘤进行辨别确诊。当然，任何一个办法都很难能够独立到达完美的检测效果，在针对肝内胆管癌的辨别确诊中，必要时也能够参加例如 arginase-1，hepatocyte，paraffin antigen 1 以及 glypican-3 等的免疫组化协助进行协同分子学确诊。
在国外研讨的基础上，国内医院的病理试验室也逐步在科研开发中对 RNAscope 在肝癌辨别确诊中的效果进行了研讨。现在的成果显现 RNAscope 技能对肝细胞肝癌和肝脏搬运瘤很好地进行辨别确诊。
以下是一例患者的肝脏肿瘤样本。患者有既往下消化道肿瘤及手术病史 2 年，后发现肝脏占位病变。免疫组化显现 CK19 成果部分阳性，CK20 染色成果阳性。为了快速有用辨别肝脏该占位病变是否为原发肿瘤仍是消化道肿瘤复发搬运，该科室的教师在患者白腊切片进步行了 ALB 的 RNAscope 检测。
成果显现 ALB 的 mRNA 在肿瘤和肝细胞内很多表达（见下图），提示该肿瘤为肝细胞原发肿瘤。协助病理教师精确快速的对其进行了辨别确诊。与此一起，有病理教师在消化体系的肝样腺癌的辨别确诊研讨中也运用 RNAscope ALB 办法协助其进行成果判别。
图中 A 为 RNAscope 2.5 HD Brown 检测试剂盒在人白腊样本中检测白蛋白（ALB）mRNA 的成果。A 图为检测后病理扫描的低倍镜截图；B，C，D 为 10 倍镜下，A 图中三个画圈区域的扩大成果。每个区域后经再次扩大后，出现了 40 倍镜下成果。
RNAscope 引荐的评分规范：
RNAscope 技能是由 Bio-Techne 旗下 Advanced Cell Diagnostics（ACD）公司研制的 RNA 原位杂交产品，在近年来的生物检测范畴发展迅速。与传统的 RNA 原位杂交比较，RNAscope 技能归于新一代 RNA 原位杂交技能，其特异性的双 Z 探针规划避免了传统长链 RNA 探针的坏处，配以本身级联扩大检测原理，能够高效灵敏地检测到方针 RNA。该办法的详细优势如下：
运用广泛：运用 RNAscope 技能，靶点 RNA 为大于等于 300 个碱基的特异序列，即可进行探针规划。因此 RNAscope 技能能够运用于简直一切物种，一切安排以及一切基因的检测。
特异性强：RNAscope 共同的双 Z（ZZ）探针规划有用的避免了探针的非特异性结合，一起降低了布景搅扰。因为结合在非特异性位点的单个的 Z 探针不会发作完好的信号扩大分子结合位点，并会在杂交进程中被洗脱掉，然后避免非特异性信号的扩大，使得探针的信号具有高度特异性。探针规划组成需求 2～4 周时刻即可完结。
灵敏度高：RNAscope 办法检测每个 RNA 分子时，只需三对双 Z（ZZ）探针即可完结杂交和信号的可视化。
单分子可视化和单细胞定量：运用 RNAscope 技能杂交上三对及以上双 Z 探针即可在规范的显微镜下出现可调查到的点状信号。ACD 公司供给的剖析软件更能够定量每一个单细胞内 RNA 的表达水平。
兼容降解的 RNA：因为 RNAscope 三对双 Z 探针即可检测到方针 RNA，而一般针对靶点 RNA 规划的探针为 20 对双 Z 探针，因此即便方针 RNA 发作部分降解，仍能够安稳有用地检测到靶点 RNA。
检测成果安稳共同性：RNAscope 技能用到的探针以及一切检测试剂悉数由工业化组成，且该技能针对不同样本类型（冰冻切片， 白腊切片，悬浮细胞，贴壁细胞等）已经有老练的试验操作流程，故使得 RNAscope 技能检测成果具有安稳性和共同性。除了能够在试验室进行手工操作外，该产品也能够在 Leica 以及罗氏 Ventana 主动平台上运转，为成果的共同性和安稳性供给了牢靠的根据。
多通道多靶点一起检测：因为 RNAscope 技能能够一起进行多通道探针杂交以及信号扩大，故在可见光检测中能够在同一张切片上一起检测两个靶点；而在荧光检测进程中，能够在同一张切片上检测三个或三个以上靶点 RNA。
不仅如此，在 RNAscope 技能基础上，ACD 公司还研制出新一代产品 basescope。
与传统的 RNA 原位杂交比较，RNAscope 技能与 basescope 技能因其特异性的双 Z 探针规划，避免了传统长链 RNA 探针的坏处，配以本身级联扩大检测原理，能够高效灵敏地检测到方针 RNA，且不需求像传统原位杂交那样要求 RNase free 的环境。RNAscope 技能能够在高度灵敏地原位检测大于 300bp 的 RNA，而 basecope 则能轻松完成 RNAscope 检测规模以外的更短序列的检测。
basescope assay 首要运用于检测短序列的 RNA 方针（50~300bp），例如本文中说到的 pre-miRNA；高度同源性序列；RNA 点骤变，例如 EGFR T790M，BRAFV600E，KRAS G12D, PIK3CA H1047R 等；外显子跳动，例如检测非小细胞肺癌中的 METD14，环状 RNA 以及基因交融。
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参考文献：
[1] Am J Clin Pathol. 2018 May 31;150(1):58-64. Detection of Albumin expression by RNA In Situ Hybridization Is a Sensitive and Specific Method for Identification of Hepatocellular Carcinomas and Intrahepatic Cholangiocarcinomas.
文章来历：ACD
图片来自：ACD
